Überträger des Bakteriums sind in der Regel Zecken, die den Erreger beim Saugen nach einigen Stunden (in der Regel in einem Zeitfenster von 8 bis 12 Stunden nach dem Einstich) auf den Menschen übertragen. In Deutschland ist das vor allem die Zecke Ixodes ricinus, auch Gemeiner Holzbock genannt. Zecken sind weltweit Überträger von mehr als 50 Krankheiten (siehe Zeckenstich).
Als weitere Überträger der Borreliose werden von Wissenschaftlern auch Stechmücken diskutiert, wobei in bisherigen Studien nur eine sehr geringe Durchseuchung von Mücken festgestellt wurde. Parasitologen der Universität Bonn sind in letzter Zeit der Frage nachgegangen, ob Laufmilben (Trombiculidae), darunter die in Deutschland heimische Herbstmilbe (Neotrombicula autumnalis), als Vektoren für das Bakterium Borrelia burgdorferi infrage kommen, es ergaben sich aber keine konkreten Hinweise. Allerdings ist hier unklar, ob diese Spinnentiere tatsächlich in der Lage sind, Borrelien auf den Menschen zu übertragen. Bekannt ist jedoch eine Übertragung durch Bremsen.
Eine direkte Übertragung der Borrelien von Mensch zu Mensch ist nicht bekannt, d. h. erkrankte Personen sind nicht ansteckend. Dagegen besteht bei einer infizierten Frau in der Schwangerschaft die Gefahr von Totgeburten oder der Schädigung des ungeborenen Kindes. Eine Übertragung durch Blutprodukte ist zwar grundsätzlich möglich, wird aber bislang als unwahrscheinlich angesehen. Nach Auskunft des Robert-Koch-Instituts ist die Borreliose nicht sexuell übertragbar. Genügend aussagekräftige Studien fehlen hierzu jedoch.
Ein großes Problem bei der Feststellung der Borreliose ist die laborchemische (serologische) Unterscheidung zwischen einer abgeheilten Borreliose (Seronarbe) von einer noch aktiven therapiebedürftigen Borreliose. Es kommt deshalb nach wie vor zu falsch negativen und falsch positiven serologischen Befunden. In der Serologie werden in der Routinediagnostik Antikörpertests eingesetzt. Das sind i.d.R. der ELISA und der Westernblot, auch Immunoblot genannt. Manche Labors führen auch einen Immunfluoreszenztest (IFT) durch. Solche Tests können nur die Antikörper messen, d.h. feststellen, ob ein Erregerkontakt stattgefunden hat oder nicht. Es ist jedoch durch diese Verfahren nicht möglich, den Krankheitsverlauf einer Borreliose zu kontrollieren. Deshalb ist auch nicht möglich, aufgrund der serologischen Ergebnisse nach einer Behandlung mit Antibiotika festzustellen, ob diese wirksam waren und die Borreliose nun ausgeheilt ist. Hinzu kommt, dass die einzelnen Testverfahren nicht standardisiert sind und eine unterschiedliche Spezifität und Sensitivität aufweisen. Bei sehr sensitiven Tests besteht oftmals das Problem von sogenannten Kreuzreaktionen. Das bedeutet, der Test zeigt ein positives Borrelien-Ergebnis an, der Betreffende hat aber keine Borreliose (Alpha-Fehler, falsch-positiv). Das wird durch andere Erreger, wie zum Beispiel durch andere Spirochäten wie Treponema pallidum oder Treponema denticola, Leptospiren, aber auch durch das Epstein-Barr-Virus oder Zytomegalievirus verursacht. Genauso kommen falsche negative Ergebnisse vor (Beta-Fehler). Die Serologie ist vor allem in den frühen Phasen nicht zuverlässiger als 50 %. Neuere Tests sollen inzwischen eine etwas höhere Zuverlässigkeit aufweisen, die mit einer Sensitivität von ca. 70 bis 80 % angegeben wird. Allerdings sind dies Angaben der jeweiligen Labors, die nicht überprüft wurden.
Es werden gerade in der Frühphase viele Borreliose-Fälle übersehen, da innerhalb der ersten Wochen noch keine messbaren Antikörperspiegel gegen Borrelienantigene gebildet werden (sogenannte diagnostische Lücke = Zeitpunkt von der Infektion bis zur ersten Antikörperproduktion). Daher sollte in Frühstadien nicht das Ergebnis einer Blutuntersuchung abgewartet werden, sondern unverzüglich bei entsprechendem klinischen Verdacht antibiotisch therapiert werden, da bei frühzeitiger Behandlung die Heilungschancen am größten sind. Eine sogenannte Wanderröte (Erythema migrans) muss sofort behandelt werden. Auch bei einer floriden Borreliose können Entzündungsparameter wie BKS, CRP und andere akute-Phase-Proteine unauffällig bleiben, so dass normale Werte dieser akute-Phase-Proteine (Entzündungsparameter) nicht geeignet sind, eine aktive Borreliose auszuschließen.
In späteren Stadien ist die Sensibilität der serologischen Testmethoden (ELISA) in der Regel höher. Sie soll im zweiten Stadium bei etwa 70 % bis 90 % liegen. Bei einem Verdacht auf eine manchmal klinisch wenig spezifische Neuroborreliose ist in der Regel eine Liquoruntersuchung angezeigt, bei der durch Feststellung entzündlicher Liquorveränderungen und den Nachweis einer borrelienspezifischen intrathekalen Antikörpersynthese sich gegebenenfalls ein solcher bestätigen lässt. Allerdings kann es hierbei bei ca. 30 % zu falschen negativen Ergebnissen kommen. Im Frühstadium der Neuroborreliose ist oftmals noch keine Infektion mit Borrelien nachweisbar. In diesen Fällen könnte das kürzliche entdeckte Chemokin CXCL13 (ein B-Lymphozyten anziehendes Protein) eine wichtige Rolle spielen, da es bereits in Frühstadien der Erkrankung im Liquor von Patienten mit Neuroborreliose deutlich erhöht ist. Nach der bisherigen Studienlage ist die Spezifität dieses Markers mit der intrathekalen Antikörpersynthese vergleichbar. Darüber hinaus sinkt die Konzentration von CXCL13 im Liquor unter Behandlung rasch ab und hilft somit eine aktive Infektion von einer Seronarbe zu unterscheiden. Bislang ist dieser Marker jedoch noch nicht in der klinischen Diagnostik etabliert, sondern wird nur im Rahmen von Studien (z. B. an der Universitätsklinik der LMU München) untersucht. Auch wenn lediglich eine Beteiligung peripher Nerven vorliegt, kann die Liquordiagnostik negativ sein. Die Zuverlässigkeit der Liquordiagnostik ist auch von der Erfahrung des Labors, zugrunde gelegten Kriterien für die Auswertung, Präparationszuverlässigkeit sowie den verwendeten diagnostischen Verfahren abhängig. In Deutschland sind zahlreiche Borrelien-Serologien mit unterschiedlichen Antigenkompositionen auf dem Markt, die eine große Bandbreite hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität aufweisen. Deshalb kann es vorkommen, dass mit einem Test negativ und mit einem anderen positive Ergebnisse festgestellt werden. Es besteht weder eine Genehmigungspflicht für die Borrelien-Serologie, noch ist eine Teilnahme an Ringversuchen verpflichtend.
In einigen spezialisierten Labors und Instituten wird bei positiver Serologie und fraglicher Erregeraktivität der LTT (Lymphozytentransformationstest) durchgeführt. Dieser Test gehört seit 2005 zu den in Deutschland akkreditierten Laborverfahren zum Nachweis zellulärer T-Zellreaktivitäten. Ein positives Ergebnis deutet auf Borrelien-spezifische T-Zellen im Blut hin und unterstützt den klinischen Verdacht auf eine aktive Borreliose. Dass wirklich eine enge Korrelation zwischen einem positiven LTT und der Krankheitsaktivität besteht, ist allerdings bislang in größeren klinische Studien nicht untersucht. Der LTT wird seit April 2006 von den Gesetzlichen Krankenkassen nicht mehr übernommen. Der PCR-Nachweis stellt eine weitere Diagnosemethode dar, mit der eine aktive Borreliose festgestellt werden kann. Hier wird aus dem Erreger DNA aufgearbeitet und mittels der PCR-Reaktion ein borrelienspezifisches Fragment vervielfältigt (amplifiziert). Dieser Test ist hochspezifisch, stellt gleichzeitig aber hohe Anforderungen an Laborpersonal und -ausrüstung. Die Sensitivität ist stark abhängig vom untersuchten Körpermaterial (Liquor bei einer Neuroborreliose etwa 20–30 %, Synovialflüssigkeit bei einer Lyme-Arthritis und Haut bei einer Dermato-Borreliose etwa 70 %). Ein negatives Ergebnis schließt eine aktive Borreliose deshalb nicht aus. Wenn Kontaminationen sowie tote Erreger ausgeschlossen werden konnten, ist ein positives Ergebnis ein Hinweis auf eine aktive Borreliose. Der Direktnachweis von Borrelien(-DNA) aus Zecken mittels PCR wird von verschiedenen Firmen bzw. Laboren angeboten. Die Kosten für die von den Krankenkassen nicht getragene Leistung liegen je nach Anbieter zwischen 10 und 100 Euro. Ein positiver Nachweis in der Zecke besagt nicht, dass auch im Menschen eine Infektion stattgefunden hat! Als alleiniger Nachweis für eine Borrelieninfektion wird dieser Test von keiner Fachgesellschaft empfohlen. Andere Aussagen sind nicht korrekt und sollten kritisch hinterfragt werden. Somit sind Therapien, die sich alleinig auf diesen Befund ohne Symptome und Serologie berufen, nicht indiziert.
In der Regel wird eine sogenannte Zwei-Stufen-Testung durchgeführt. Es wird erst ein ELISA eingesetzt, der jedoch Kreuzreaktionen bzw. polyklonale Antikörperstimmulierungen durch andere Krankheitserreger aufweisen und deshalb falsch-positiv sein kann. Das Ergebnis wird durch einen Immuno- bzw. Westernblot verifiziert und bestätigt. Bei negativem ELISA-Test und fortbestehendem klinischen Verdacht auf eine Borreliose empfiehlt sich die Durchführung eines Westernblot.